β-Talesemi Hastalarında; Tek Hücreden PCR sonrası DNA dizileme yöntemi kullanılarak mutasyon ve polimorfik bölge araştırması

Embriyo genotipinin analizi iki aşamalıdır: Araştırılacak gen lokusunun PCR amplifikasyonu ve amplifiye gen ürününün seçilecek metodla genotiplemesinin yapılması. Bir çok genetik hastalık için literatürde değişik metodlar bulunmaktadır. Bunların pek çoğunda teknik problemler yaşanmaktadır.Bir araştırmaya göre dünya çapında 296 milyondan fazla insan globulin genindeki bir bozukluktan kaynaklanan talasemi hastasıdır (Angastiniotis ve Modell, 1998).
β-Talesemi; β-globin zincir sentezinin hiç olmaması veya azlığından kaynaklanan, fenotipik varyasyonlar gösteren, otozomal resesif bir kan hastalığıdır.Kromozom 11 üzerinde bulunan β-globin geninde; β-Talesemi hastalığına neden olan, 100’den fazla farklı mutasyon tanımlanmıştır. Her iki kromozomda da mutasyon olması durumunda kişi majör talasemi hastası olur, yaşam boyunca aylık olarak kan transfüzyonu gerekir ve kardiyak bozukluklar gibi fizyolojik ciddi komplikasyonlar sonucu ölümle sonuçlanabilir. Bu büyük problemle başedebilmek için sadece β-Talesemi hastalarının ve ailellerinin değil tüm toplumun hastalığa karşı bilinçlendirilmesi ve β-Talesemi önleme programına alınmaları gereklidir. Şüpheli durumlarda genelikle prenatal tanı testlerinden, chorionic villus sampling (CVS) veya amniyonsentez uygulanarak, hastalıktan etkilenmiş hamileliklerin sonlandırılması yöntemi uygulanmaktadır. Bu uygulamada çok sayıda hastalıktan etkilenmiş hamileliğin sonlandırılmak zorunda kalınması, aileler üzerinde olumsuz etkiler yaratmaktadır. Tüm bu nedenlerden dolayı PGD, etik olarak uygulanabilir görünmektedir. PGD bir çok genetik hastalık için uygulanabilir olsa da allel drop-out (ADO) nedeniyle tanıda bazı güçlükler bulunmaktadır. ADO; allel çiftlerinden birinin amplifiye olmaması durumudur. Olay homozigot lokuslarda meydana gelirse PCR amplifikasyonunun hiç olmaması durumuyla karşılaşılır. PGD’nin yüksek doğrulukta yapılabilmesi için embriyoda kalıtılan kromozomların mutasyon taşımadıklarından emin olunması gerekir. Tüm bu nedenlerle β-Talesemi hastalığında PGD; restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesim yapılarak veya denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) yöntemiyle yapılmaktadır.
β-Talesemi hastalığında PGD uygulamasında, direkt DNA dizileme yöntemi ile polimorfik marker ve mutasyon araştırmasının birlikte uygulanması, daha basit ve doğruluk oranı daha yüksek bir yöntemdir. Polimorfik bölgede aynı pozisyonda iki ayrı nükleotidin bulunması, iki PCR ürününün oluştuğunu, dolayısıyla ADO’nun gerçekleşmediğini gösterir. Bu ise tanının doğruluğunu arttırır.

Materyal ve metod

β-Talesemi taşıyıcısı oldukları bilinen üç çift üzerinde PGD yöntemi uygulanmıştır. Çiftler fertil olarak kabul edilmektedirler. Kadınlardan birinde; 39. kodon, 1. nükleotidte heterozigot C>T mutasyonu ile IVS I (intervening sequence) bölgesinde 6. nükleotid T>C mutasyonları compound (birleşik) olarak bulunmaktadır. Orta düzeyde talesemi hastası olarak tanımlanmıştır ve hemoglobin düzeyi 7. derecede stabildir. Hikayesinde özenli bir şekilde tedavi gördüğü ve birkaç kez kan transfüzyonu yapıldığı görülmüştür.
Eşi; IVS I-110 bölgesinde G>A mutasyonunu taşımaktadır ve semen parametreleri normaldir.

Embriyo biyopsisi ve tek blastomerin izolasyonu

Anneden alınan oositlerin ICSI yöntemiyle fertilizasyonu yapıldıktan sonra 3. günün sabahına kadar kültüre bırakılmıştır ( embriyo 5-10 hücrelik duruma genellikle bu sürede ulaşır). Fertilase™ sistemiyle zona pellucida delik oluşturularak 30 μm’lik biyopsi pipetiyle bu delikten bir blastomer aspirasyonla çekilir. Blastomer üç kez, çekmeli pastör pipeti kullanılarak 0.01% PVP eklenmiş 1XPCR buffer (50mmol/L KCL, 10mmol/L Tris-HCL, pH 8.3) ile yıkanır. Blastomer diseksiyon mikroskobu altında kontrol edilerek 0.5 ml PCR tüpüne yerleştirilir. Blastomer tüpe yerleştirildikten sonra pipetin içerisinde kalan buffer başka bir PCR tüpüne aktarılır ve negatif kontrol olarak kullanılır. Embriyo transferi 4. veya 5. günde yapılır.

İlk aşama PCR
İlk aşama nested PCR de modifiye edilmiş yöntem kullanılmıştır (Kuliev ve ark. 1998). İki çift dış primer takımı ile (Tablo I, Şekil 1) β-globin geninin IVS I ve IVS II bölgelerinin amplifikasyonları eşzamanlı olarak yapılmıştır. Tek hücre liziz yöntemi; 5 μl liziz buffer (200 mmol/L KOH, 50 mmol/L dithiothreitol) ile 10 dk. 65°C’de bekletilir; takiben 5 μl nötralizasyon buffer ile (300 mmol/L KCl, 900 mmol/L Tris–HCl, pH 8.3, 200 mmol/L HCl) nötralizasyon yapılmıştır. Lizatlar dikkatli şekilde santrifüj edilmiş ve hemen buz üzerine alınmıştır ( daha sonra kullanılacaksa -20°C de saklanabilir). Lizasyonu ve nötralizasyonu yapılmış hücrelerin herbirine (10 μl), 40 μl master mix karışımı eklenir ( Master mix: 10 μl 10% gliserol veya distile su, 3 μl 25 mmol/L MgCl2, 8 μl 10 mmol/L dNTP mix (2.5 mmol/l her birinden), 20 pmol her bir primer (Tablo I), (0.3 μl) 1 IU Taq polimeraz (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA). Karışımın üzerine 50 μl’ye tamamlayacak kadar PCR grade water (Biotech International, Perth, WA, Australia) eklenir ve üzeri mineral PCR yağı ile kaplanır.
PCR tüpleri aşağıdaki şartlarla amplifikasyona alınır:

96°C de 5 dak.= Denatürasyon (Tek döngü)
96°C de 30 s
45°C de 1 dak. 28 Döngü
72°C de 1 dak.
72°C de 5 dak. = Son uzama (Tek döngü)

Tablo 1: İlk aşama duplex PCR için primer dizileri

İkinci aşama PCR
İkinci aşama PCR’de; IVS I ve IVS II bölgeleri iç primerler kullanılarak amplifiye edilir (Tablo 2). İlk aşama PCR ürününden 3.5 μl, reaksiyona giren madde olarak kullanılır. Master mix: 5 μl 10XPCR buffer (500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris–HCl, pH 8.3), 3 μl 25 mmol/L MgCl2, 4 μl 10 mmol/L dNTP mix (2.5 mmol/L herbirinden ), 20 pmol forward ve revers primerlerin herbirinden, (0.3 μl) 1 IU Taq polimeraz eklenerek ultra-pure water ile hacim 50 μl’ye tamamlanır. Üzerini kaplayacak kadar mineral yağ eklenerek ısı döngüleyiciye (thermocycler) yerleştirilir.

Nested amplifikasyon için:
96°C de 4 dak. = Denatürasyon (Tek döngü)
94°C de 45 s
52°C de 60 s 25 Döngü
72°C de 60 s
72°C de 5 dak. = Son uzama (Tek döngü)

Heminested amplifikasyon için:
96°C de 5 dak. = Denatürasyon (Tek döngü)
94°C de 45 s
62°C de 45 s 25 Döngü
72°C de 60 s
72°C de 5 dak. = Son uzama (Tek döngü)

PCR ürünü etidyum bromid ile boyanarak, 2%’lik agaroz jelde (0.5 X TBE (Tris, borat, EDTA) içerisinde) yürütülerek amplifikasyonun doğrulanması amacıyla fotoğraflanır.

Döngü dizileme (cycle sequencing) şartları:
96°C de 30 s= Denatürasyon (Tek döngü)
96°C de 10 s 25 Döngü
53°C de 5 s
60°C de 4 dak. = Son uzama (Tek döngü)

Döngü dizileme reaksiyon ürününün presipitasyonu izopropanol yöntemiyle (veya üretici firmanın önerdiği yöntemle) yapılır. İzopropanol metodu jel veya kapillerli cihazlarla uygulanabilir:
Reaksiyon ürününün üzerine 40 μl 75%’lik izopropanol eklenerek oda ısısında 15 dak. bekletilir ( gece boyunca bırakmayınız). Örnekler 12 000 g ‘de 20 dak santrifüj edilir ve süpernatant atılır. Pelletin üzerine tekrar 250 μl 75% izopropanol eklenerek hafifçe vortexlenir. 12 000 g ‘de 5 dak. santrifüj edilir, süpernatant atılır ve dikkatlice kurutulur. Örnekler ABI dizileme cihazları ile analiz edilir.

Mutasyonların resmini büyütmek için üzerine tıklayınız